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活細(xì)胞骨架染色:實(shí)時(shí)觀察3D細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境與細(xì)胞遷移的互作用

更新時(shí)間:2016-07-08   更新時(shí)間:2016-07-08   點(diǎn)擊次數(shù):3900次

2D細(xì)胞外基質(zhì)(ECMs)的物理特性會影響到細(xì)胞的粘附動態(tài)和形態(tài),但是3D細(xì)胞外基質(zhì)的局部微環(huán)境對細(xì)胞的影響卻知之甚少。美國的科研人員構(gòu)建了幾種3D膠原基質(zhì),研究其微結(jié)構(gòu)的變化對于調(diào)節(jié)3D狀態(tài)下的細(xì)胞粘附動態(tài)和細(xì)胞遷移的影響。細(xì)胞外基質(zhì)中有各種成束的纖維會加強(qiáng)局部可粘位點(diǎn)的堅(jiān)固性,并且可以通過ECM/粘附偶聯(lián)點(diǎn)增強(qiáng)細(xì)胞的粘附穩(wěn)定性,并且高度柔軟的網(wǎng)狀聯(lián)合促進(jìn)了粘附的收縮力。3D粘附的動力學(xué)由局部的ECM的強(qiáng)度和整合素/ECM還有II型肌球蛋的收縮白共同調(diào)節(jié)。不同于2D遷移,3D的細(xì)胞遷移不僅受ECM孔徑大小影響。

 

科研人員需要觀察活細(xì)胞的在成束的纖維中細(xì)胞前沿的突出點(diǎn)的形態(tài)變化,和細(xì)胞運(yùn)動的軌跡。使用LifeAct標(biāo)記細(xì)胞的F-actin能夠不影響細(xì)胞功能和行為的情況下對細(xì)胞進(jìn)行觀測。研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞會將細(xì)胞前進(jìn)的邊緣沿著成束的纖維長邊移動。具有接觸導(dǎo)向的作用,這一點(diǎn)在纖維和細(xì)胞前進(jìn)邊緣平行時(shí)尤為明顯。而纖維母細(xì)胞在不同的ECM中也顯示出了類似的特性,是將纖維拉向細(xì)胞自身的同時(shí)將偽足向前延伸,并遷移的。

 

Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions

Andrew D. Doyle,Nicole Carvajal, Albert Jin,Kazue Matsumoto& Kenneth M. Yamada

Nature Communications 6, Article number: 8720 doi:10.1038/ncomms

 

 

(一)實(shí)驗(yàn)材料

  • 細(xì)胞:     fibroblast            (gift from NIDCR/NIH)
  • 試劑:    LifeAct-TagGFP2 質(zhì)粒    (ibidi, Germany)

             Phenol red-free DMEM      (Hyclone)

             FBS                        (Hyclone)

             L-glutamine           (GIbco)

             Anti-collagen I         ( Millipore,1:200, Cat# ABT-123)

  • 儀器:   電轉(zhuǎn)儀                 (Bio-Rad Gene Pulsar TM)

 

 

(二)實(shí)驗(yàn)步驟

  1、LifeAct-GFP轉(zhuǎn)染

 使用0.4cm的電擊杯,設(shè)定電壓為170V, 960uFd,持續(xù)時(shí)間17-22μs。

  2、collagen I 預(yù)染

  • 5ml 的3mg/ml的collagen1在室溫固化
  • 之后,膠置于50mM的硼酸鹽緩沖液(pH 9.0)中孵育10min
  • 室溫避光條件下使用灌流管逐漸用含有NHS脂染料的硼酸鹽溶液逐漸替換之前的緩沖液并孵育1小時(shí)。
  • 保持染料一直處于灌流的狀態(tài),并且在孵育用TRIS溶液沖洗10分鐘,并用PBS沖洗數(shù)小時(shí)移除沒有結(jié)合的染料
  • 使用200mM的鹽酸溶解已凝固的膠知道所有的膠溶解
  • 以1:1000的比例用20nM的冰醋酸透析上述膠溶液4小時(shí)
  • 實(shí)驗(yàn)前,用標(biāo)記過的collagen I替換2-4%的未標(biāo)記的collagenI,并和細(xì)胞混勻,開始試驗(yàn)。

 

  • 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 

如圖所示:表達(dá)EGFP-LifeAct的fibroblast(綠色或灰色)在FB4 ECM(紅色)中的活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。從時(shí)間序列的拍攝結(jié)果可以看出,細(xì)胞一直是沿著纖維的方向,將actin富集到細(xì)胞的絲狀偽足(白箭頭)中,控制細(xì)胞的遷移方向。星號代表了一條膠原纖維起止位置,青色的線作為其位置的參照物表明,細(xì)胞是通過將纖維拉向自己的方式來向前移動的。

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