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免疫熒光實驗iPSC-derive神經元的體外神經毒性檢測

更新時間:2016-06-16   更新時間:2016-06-16   點擊次數(shù):4617次

如今神經毒性檢測主要是依賴活體動物實驗,不僅有倫理問題,而且通常非常昂貴并且十分耗時。當需要大規(guī)模的測試化合物的時候就不太合適了。因此,高通量的體外的神經毒性測試就顯得十分必要了,而且可以使用人源的細胞直接進行試驗,試驗結果的實用性也更佳。但是,到目前為止,人源干細胞誘導的神經元并沒有適合進行這類試驗的特質,試驗時間較長,批次間差異大,并且有收到倫理和一些法律的制約,使得這種細胞都不太適用于做大規(guī)模的體外測試試驗。近,市面上出現(xiàn)了商用的人源iPSC-derive神經元細胞,重復性好,可以用來做這類的體外神經毒性試驗。

荷蘭的科學家使用人源iPSC-derive神經元細胞做了免疫熒光染色試驗,作為高通量進行體外的神經細胞毒性檢測的預試驗。由不同供應商提供的人源iPSC-derive神經元細胞混合培養(yǎng)能夠形成不同(激活型或抑制型)神經元共培養(yǎng)的樣本。

 

ALTEX. 2016 Mar 24. doi: 10.14573/altex.1510091

Is the time right for in vitro neurotoxicity testing using human iPSC-derived neurons?

Tukker AM1, de Groot MW1, Wijnolts FM1, Kasteel EE1, Hondebrink L2, Westerink RH1.

 

一、實驗材料

1)細胞: iCell® Neurons (NRC-100-010-001,Cellular Dynamics international)

          CDI iCell® Astrocytes(Cellular Dynamics international)

          HIP neurons (GSC-4312, MTI-GlobalStem)

          DOPA.4U® neurons (Axiogenesis, Cologne, Germany)    

2)培養(yǎng)基:Complete iCell Neurons Maintenance Medium (with 2% iCell Neurons Medium Supplement) supplemented with laminin (10 μg/mL)

3)試劑: Poly-L-Ornithine ([PLO] 0.01%)

4)培養(yǎng)耗材:µ-Slide 8孔腔室載玻片,ibiTreat底部處理 (ibidi,Germany,80826)

 

二、實驗方法

一)載玻片包被

① 每孔加入300μl 的  0.01%的Poly-L-Ornithine 溶液

② 室溫孵育60分鐘

③ 吸除所有液體并小心用PBS沖洗5-10分鐘,即可開始使用

二)免疫熒光實驗

1)鋪細胞:

iCell® Neurons 每孔鋪100000個細胞

iCell® Neurons/CDI iCell® Astrocytes共培養(yǎng),每孔鋪66000個細胞

HIP neurons 每孔鋪100000個細胞

DOPA.4U® neurons 每孔鋪52000個細胞

DOPA.4U® neurons/iCell® Astrocytes共培養(yǎng),每孔鋪48000個細胞

 

2)加入約300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液,靜置15分鐘

3)加入300μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘

4)加入300μl 2% BSA的PBS溶液封閉20分鐘

5)依次加入一抗,二抗進行免疫熒光染色后,沖洗小室并加入封片液進行顯微鏡觀察(圖二)。

 

圖二:圖示鋪細胞,固定,清洗,染色步驟。

 

三、實驗結果

 

 

圖三:iPSC-derive神經元的免疫熒光染色結果。不同種類的人源iPSC-derive神經元使用β(III)tubulin(綠色)和GFAP(紅色),用來區(qū)分神經元和星型膠質細胞(HIP® neurons, 左上;DOPA.4U® neurons,左下;iCell neurons,右上。) Human iCell 神經元用vGAT (綠色) 和vGluT (紅色)確定抑制或激活突觸(右下)。細胞核使用DAPI染色(藍色)。

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