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探討流體剪切力對細胞活動的影響

更新時間:2016-05-05   更新時間:2016-05-05   點擊次數(shù):2725次

探討流體剪切力對細胞活動的影響--流體剪切力對細胞吸收人造細胞器的影響

      丹麥奧胡斯大學(xué)的納米科學(xué)近日在SMALL雜志上發(fā)表了一篇關(guān)于納米材料作為有細胞活性人造細胞器的文章。文章介紹了個有趣的現(xiàn)象:細胞在剪切力條件下培養(yǎng)的時候,會吸收更多的納米顆粒,并且沒有附加的細胞毒性。
    文章中采用了內(nèi)皮細胞和巨噬細胞做為實驗細胞。將細胞培養(yǎng)在ibidi通道載玻片中,之后使用含有納米顆粒的培養(yǎng)基,以一定的剪切力刺激細胞,細胞吸收的納米顆粒的量比靜置狀態(tài)下有顯著的升高。
        分享一下這個實驗的細節(jié),或許大家可以從中找到自己研究領(lǐng)域的靈感。

一、實驗準(zhǔn)備實驗材料及設(shè)備
1.細胞: 內(nèi)皮細胞、巨噬細胞
2.納米顆粒:pPDA:在800nm直徑的二氧化硅表面包被多聚多巴胺(dopamine)
             pPEG:在800nm直徑的二氧化硅表面包被多聚乙二醇(ethylene glycol)
             pRGD:在800nm直徑的二氧化硅表面包被L-精氨酸、甘氨酸和L-天門冬氨酸的多聚物(Arginylglycylaspartic acid ( RGD ) is a tripeptide composed of L -arginine , glycine , and L -aspartic acid)
3.培養(yǎng)耗材:ibidi六通道載玻片μ-Slide VI0.4 Luer (ibidi,Germany,80606)
             灌流管,15cm,1.6mm直徑(ibidi,Germany,10962)
             串聯(lián)管(ibidi,Germany,10830)
             封口夾 
1.儀器設(shè)備:ibidi流體剪切力系統(tǒng),含空氣泵(ibidi,Germany,10905)和流體單元(ibidi,Germany,10903)

二.實驗方法
在實驗開始前一天,請將所有需要使用的試劑,培養(yǎng)基,通道載玻片,灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置第二天,排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。

一)培養(yǎng)細胞
準(zhǔn)備內(nèi)皮細胞和巨噬細胞,按照常規(guī)細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。好使用比較健康的內(nèi)皮細胞,以防在做流體實驗時候細胞不能穩(wěn)定貼壁。

按照下面流程鋪細胞:
1.按每通道10000個巨噬細胞和40000個內(nèi)皮細胞將細胞鋪于通道載玻片的中,注意,將移液器頭插入注液孔中再加入細胞懸液,可以輕微傾斜通道載玻片幫助細胞懸液充滿整個通道。
2.蓋上注液孔蓋,將通道載玻片放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時,等待細胞貼壁。細胞貼壁后,拿出通道載玻片,在每個注液孔中分別加入60μl培養(yǎng)基,注意,槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基。
3.將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)2-4小時左右,等到細胞剛剛長滿為單細胞層,即可開始實驗。注意,要使用單層細胞進行剪切力實驗,使每個細胞均受到均勻的剪切力。

二.搭建流體系統(tǒng)
1.將灌流管按照說明放在置在流體單元上。在灌流管的儲液管中加入含納米顆粒的7.5ml培養(yǎng)基。這時不需要連接通道載玻片。實驗前需要去除整個灌流管中的氣泡,存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會影響剪切力的大小,有時還會使灌流系統(tǒng)中的液體流動停滯。打開ibidi泵控制系統(tǒng),在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”,ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動運行下面任務(wù),用于去除氣泡。(表一)
  

2.連接通道載玻片。使用串聯(lián)管,將通道串聯(lián)起來。這樣可以在同一個條件,同一種液體的刺激下培養(yǎng)不同的樣本。

在細胞貼壁后,將串聯(lián)管如如圖示插入串聯(lián)管

在每一個注液孔中加滿培養(yǎng)基,要注意不能把氣泡加入在注液孔中。

用1ml的無菌注射器吸滿培養(yǎng)基,小心插入如圖的孔中,不要引入氣泡。

小心推入培養(yǎng)基,直到*個串聯(lián)管有培養(yǎng)基微微冒出。

小心的將串聯(lián)管彎過來,插入相鄰的注液孔中。不要產(chǎn)生氣泡。

繼續(xù)推動注射器,直到第二根串聯(lián)管也被充滿,繼續(xù)推動注射器充滿下一根串聯(lián)管。

重復(fù)上面的操作,繼續(xù)充滿所有的通道和串聯(lián)管。

將所有的串聯(lián)管連接好后,將加滿液體排除氣泡的灌流管用封口夾夾住。

小心將灌流管的一個魯爾接頭從聯(lián)通管中拔出,插入后一個注液孔中。

小心將注射器移除,在注液孔中加滿培養(yǎng)基,將灌流管的另一個接頭插入。

串聯(lián)灌流系統(tǒng)搭建完成。


三 實驗結(jié)果

如圖所示,對于內(nèi)皮細胞和巨噬細胞,在剪切力為г4=4 dyn/cm2時比靜置條件г0吸收pRGD這種納米材料有非常顯著的升高。

聯(lián)


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