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ibidi µ-Slide VI 0.4 免疫熒光實驗,四步簡單操作,小白也輕松上手!

更新時間:2023-07-10   更新時間:2023-07-10   點擊次數(shù):1212次

  免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。本文將介紹免疫熒光實驗的新方法;此文將描述在通道載玻片內(nèi)培養(yǎng)大鼠成纖維細(xì)胞(Rat1)的單個實驗案例。然后再用AlexaFluor®488鬼筆環(huán)肽染色F-肌動蛋白細(xì)胞骨架,并用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。  

  

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  細(xì)胞免疫熒光實驗包括四個主要步驟:

  

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  1、培養(yǎng)

  

  • 在無菌條件下打開 μ-Slide VI 0.4、ibiTreat (80606) 的包裝,并將其放在 μ-Slide 架 (80003) 上。

  

  • 在每個通道中加入 30 μl 3x105細(xì)胞/ml 大鼠成纖維細(xì)胞(Rat1)細(xì)胞懸液。如下圖所示或我們的網(wǎng)站上所示,直接將移液器加入通道。  

  

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  • 用隨附的蓋子蓋住。

  

  • 將載玻片放入培養(yǎng)箱 (37 °C; 5% CO2) 培養(yǎng)并讓細(xì)胞附著 (60 分鐘)。然后用 60 μl 無細(xì)胞培養(yǎng)基填充兩個通道口。

  

  • 孵育過夜。

  

  2、固定和透化

  

  在固定和透化過程中要小心,通道永遠(yuǎn)不要變干!通過用下一個沖洗剩余的溶液來交換通道中的液體

  

  固定:

  

  • 使用細(xì)胞培養(yǎng)抽吸裝置從所有通道口中吸出培養(yǎng)基。用 Dulbecco PBS 洗滌細(xì)胞,方法是將 200 μl 緩慢加入每個通道的一個空通道口,并從每個通道的相對通道口吸出。不要吸出整個通道體積。

  

  • 用約 100 μl 3.7% 多聚甲醛的 PBS 固定細(xì)胞。20 分鐘后,通過用 200 μl PBS 填充一孔并從另一孔中吸出來沖洗通道內(nèi)的液體;確保通道-不干涸。

  

  透化和封閉:

  

  • 如上所述,用 200 μl PBS 再次洗滌細(xì)胞。

  

  • 在 PBS 中用 ~100 μl 0.1% Triton® X-100 3-5 分鐘。

  

  • 用 PBS 洗滌細(xì)胞。

  

  • 用 ~100 μl 封閉溶液(PBS 中的 1% BSA)20 分鐘。

  

  • 用 PBS 洗滌細(xì)胞。

  

  3、染色

  

  • 使用抽吸裝置從通道中取出所有液體。不要讓通道變干。

  

  • 吸液后立即加入 30 μl Alexa Fluor® 488 鬼筆環(huán)肽(在 200 μl PBS 和 1% BSA 中)。用 1 毫升注射器注射溶液會有所幫助。在室溫下孵育 20 分鐘。

  

  • 用 PBS 洗滌細(xì)胞。

  

  • 用 30 μl DAPI (0.1 μg/ml) 3-5 分鐘。

  

  • 用 PBS 清洗細(xì)胞并應(yīng)用 ibidi 封固培養(yǎng)基,直到通道被填滿(約 50 μl)。ibidi 封固劑以甘油為基礎(chǔ),并含有用于抗褪色的 DABCO。載玻片可存放約4 周。

  

  4、成像

  

  在熒光顯微鏡下選擇適當(dāng)?shù)臑V鏡,也可以使用浸油觀察細(xì)胞。  

  

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  之所能如此簡便完成免疫熒光實驗,是因為這些ibidi培養(yǎng)皿和載玻片的底部為特殊處理的材質(zhì),絕大多數(shù)細(xì)胞可以直接貼壁生長,而不需要另外包被。同時,這些耗材的底部薄如蓋玻片,可以直接使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察,得到高質(zhì)量的成像,適用于顯微鏡比如共聚焦顯微鏡。

  

  實驗例子:

  

  超分辨率顯微鏡 (STED)觀察肌動蛋白細(xì)胞骨架

  

  μ-Slide VI 0.4與超分辨率顯微鏡方法兼容,使用 LifeAct-TagGFP2 蛋白,可以詳細(xì)觀察肌動蛋白細(xì)胞骨架。在這個實驗中,固定的 Rat1 成纖維細(xì)胞與 LifeAct-TagGFP2 蛋白一起在 μ-Slide VI 0.4,ibiTreat中孵育。并用 STED 顯微鏡以創(chuàng)建超分辨率圖像。  

  

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  使用LifeAct-TagGFP2 蛋白對 Rat1 成纖維細(xì)胞中的肌動蛋白細(xì)胞骨架進(jìn)行超分辨率顯微鏡檢查。使用 Plan-Neofluar 100x/1.4 物鏡在 STEDYCON 超分辨率 STED 納米顯微鏡系統(tǒng)(Abberior Instruments GmbH,德國哥廷根)上進(jìn)行顯微鏡檢查。

  

  μ-Slide VI 0.4用于獲取人 BJ 成纖維細(xì)胞的共聚焦圖像。用 Drp-1 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用 MitoTracker Red 染色以觀察融合的線粒體。在 ibidi μ-Slide VI 0.4中培養(yǎng)的人 BJ 成纖維細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖像。MitoTracker Red(紅色)用于可視化線粒體。

  

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